El tratamiento secundario elimina la materia orgánica soluble, nutrientes como el nitrógeno y el fósforo, y la mayoría de los sólidos en suspensión que escapan al tratamiento primario. Muy a menudo, se utilizan procesos biológicos en los que los microorganismos metabolizan los compuestos orgánicos y los nutrientes para proliferar y reproducirse. Los dos procesos biológicos de tratamiento secundario más comunes son los sistemas de biomasa en suspensión y de biomasa fija. Un proceso de biomasa en suspensión fomenta el crecimiento de flóculos de microorganismos en suspensión a partir de organismos individuales ya presentes en las aguas residuales y en los lodos activados de retorno. Los flóculos contienen organismos que pueden eliminar los contaminantes a través de entornos aeróbicos, anóxicos y anaeróbicos. Una vez eliminados los contaminantes, los flóculos se envían a un proceso de decantación secundario donde se separan del agua mediante gravedad. Una parte de los lodos situados en el fondo del decantador secundario se dirige de nuevo aguas arriba para mezclarla con el efluente principal (lodos activados de retorno) para crear un licor mezcla. El resto de los lodos se retira del proceso (lodos activados de desecho) para crear la ecología ideal de microorganismos. En los sistemas de biomasa fija los microorganismos se adhieren a un medio y crean una biopelícula. Las aguas residuales asentadas se mezclan o se rocían sobre el medio revestido de biopelícula donde los microorganismos eliminan los contaminantes. Al igual que en el proceso de biomasa en suspensión, los fragmentos de biopelícula y los flóculos suspendidos se envían a un decantador secundario para su separación donde los lodos se reciclan y desechan, y el agua limpia se vierte al siguiente proceso.
Para que el tratamiento biológico funcione eficazmente, los organismos requieren nutrientes en una proporción equilibrada, entre los que se incluyen carbono, nitrógeno y fósforo (conocida como C:N:P), así como elementos traza, como hierro, cobre, zinc, níquel, manganeso, potasio, azufre y otros componentes que están normalmente presentes en las aguas residuales. La proporción C:N:P comúnmente aceptada es de 100:5:1, aunque algunas instalaciones prosperan fuera de esta proporción, mientras que otras experimentan la formación de limo de polisacáridos o el crecimiento de bacterias filamentosas que inhiben la biología y el asentamiento en el decantador secundario.
Se pueden emplear varios procesos biológicos para completar el tratamiento secundario, incluidos tanques de aireación secundario de flujo pistón, tanques de aireación de mezcla completa, reactores por carga secuencial (SBR), canales de oxidación, filtros percoladores, reactores biológicos de lecho móvil, lodos activados de película fija integrada, entre otros.
La eliminación biológica de nutrientes (BNR) altera el entorno de los microorganismos para eliminar el nitrógeno y el fósforo del agua. Un proceso de BNR consta de fases anaeróbicas (sin oxígeno ni nitrato), anóxicas (sin oxígeno, pero con nitrato presente) y aeróbicas (oxígeno presente), durante las cuales el agua se desplaza a través de una serie de cámaras para realizar diversas funciones biológicas.
También se pueden utilizar procesos de tratamiento químico, tales como la eliminación química de fósforo. Al introducir un precipitante químico en el tanque de aireación y los decantadores, el fósforo se elimina mediante floculación, creando compuestos insolubles que sedimentan y se pueden eliminar en forma de lodo.